К февралю 1500 г., спустя два года после того, как Бабур покинул Самарканд, он отобрал у своего брата такую часть земель Ферганы, что Джахангир пожелал заключить договор. Каждый из царевичей получал власть над половиной Ферганы, но они должны были объединить свои силы, чтобы вернуть Самарканд: как только Бабур вновь утвердит свои права на Самарканд, Фергана переходит целиком к Джахангиру. Таким образом, честь и честолюбие стали побудительными стимулами к объединению в борьбе за возвращение Самарканда. В течение столетия город много раз переходил из рук в руки, но всегда от одного темурида к другому. Теперь же он был захвачен опасным человеком, вторгшимся в родовое гнездо темуридов. Его имя Шейбани-хан, и эта личность в последующие десять лет будет вносить радикальные коррективы в планы Бабура.

Бабур рассчитывал, что жители Самарканда не слишком восторженно относятся к своим новым хозяевам и что, если он войдет в город, население его поддержит. Получив от своих разведчиков информацию о том, что Шейбани, занятый усмирением окрестных земель, оставил для охраны Самарканда небольшой гарнизон, Бабур решился на отчаянный шаг. В сопровождении нескольких сторонников, темной безлунной ночью, он пробрался в город, а утром атаковал застигнутых врасплох узбеков. Жители узнали своего любимого правителя и бросились ему на помощь с палками и ножами. Когда Шейбани вернулся из карательного похода, Самарканд снова был в руках Бабура, и ему пришлось ретироваться под градом стрел, которые летели в его воинов со стен и крепостных валов.

Зимой 1500 г. Бабур, находясь в Самарканде, сформировал небольшую армию, а весной выступил с ней против узбекского войска, стоявшего около Бухары. Армия Шейбани-хана, более многочисленная и лучше вооруженная, одержала победу. Бабур сумел прорваться с десятком верных людей и вернуться в Самарканд. На следующий день узбеки окружили город. Когда припасы закончились, Бабур капитулировал, дабы не подвергать население ужасам осады и штурма. Когда Шейбани с триумфом входил в сдавшийся город, Бабур с помощью жителей уходил через другие ворота. Так он потерял Самарканд во второй раз. На тот момент Бабуру было всего лишь восемнадцать лет.

Собственное владение Бабура в Фергане также было захвачено врагами. Оставшийся без удела Бабур отправился к своему дяде Махмуд-хану, правителю Ташкента, который, однако, не дал ему в управление ни одного из своих городов, на что Бабур, несомненно, рассчитывал. Тогда в 1503 г. он оставил дядю и решил попытать счастья в чужом краю.

Ему пришлось скрываться целый год у бедных кочевников-кыргызов, чтобы не попасть в руки Шейбани-хану, который назначил награду за его голову. В Мавераннахре не оставалось места, где он мог чувствовать себя в безопасности, поэтому Бабур попросил убежища у своего двоюродного брата Хусейна Байкары, правителя Герата. В июне 1504 г. в сопровождении своих соратников он направился на юг с намерением достичь Хорасана через горную цепь в Туркестане. Бабур так пишет об этом переходе: «Тех, кто шел рядом, веря в свою счастливую звезду, было не более трех сотен; оружием им служили только палки, обувь и одежды их были в жалком состоянии. Наше положение было настолько тяжелым, что мы располагали только двумя шатрами, и свой я отдал матери».

На этот раз Бабур не дошел до Герата, потому что по дороге к нему присоединились около 15 тыс. человек, также спасавшихся от Шейбани-хана, и он получил сообщение, которое круто меняло его судьбу: один из его дальних родственников был изгнан из Кабула местным вождем.

У Бабура сразу созрел план – использовать новых сторонников для того, чтобы вернуть Кабул. Он изменил направление, со своей маленькой армией перешел Гиндукуш и, несмотря на холод, голод, высоту и снег, преграждавшие путь, неожиданно появился у стен Кабула, в результате чего узурпатор обратился в бегство. Теперь Бабур мог расширить свои завоевания на всю провинцию.

Так в его власти оказалась территория, которая имела исключительно стратегическое значение: это были ворота в Индию, через которые проходили все завоеватели, включая Великого Темура. Но на тот момент мысли Бабура были заняты севером, потому что Шейбани-хан, продолжая свой победный поход, овладел Хивой, осадил Балх и угрожал Герату.